实时聚合酶链反应检测曲霉DNA诊断侵袭性肺曲霉感染的实验研究

赵蓓蕾¹ 江浩² 孙辉明¹ 施毅¹
1. 南京军区南京总医院ICU协作中心, 2. 南京市第二医院

目的 评价实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中烟曲霉DNA对侵袭性肺曲霉病（IPA）的诊断价值。
方法 成年SD大鼠30只，随机分为烟曲霉肺感染组、烟曲霉口咽定植组，每组15只。气管滴入法建立大鼠IPA模型，口咽滴入法建立烟曲霉口咽定植模型。分别于接种完成后第1d、第4d、第7d处死大鼠，取各组大鼠心脏血和BALF，离心取下层沉淀-20℃保存，待做RT-PCR检测；取肺组织做培养和病理检查。RT-PCR方法：选取烟曲霉rDNA的ITS1设计引物和探针，反应参数为50℃×2min、95℃×10min、（95℃×15s﹢60℃×1min，40cycle）。检测结果以Ct值表示，起始DNA越多，Ct值越小。
结果 ①肺组织病理检查：烟曲霉感染组大鼠第4d、和第7d均见明显炎症反应，第1d肺组织中未见曲霉菌丝，第4d和第7d可见曲霉菌丝或孢子，14只大鼠肺组织培养曲霉阳性；烟曲霉口咽定植组大鼠肺组织未见明显炎症反应，14只大鼠口咽拭子培养曲霉阳性。②RT-PCR检测结果：烟曲霉感染组和定植组大鼠血清检测Ct值分别为23.8±2.11和26.3±1.26，两组比较P＜0.05；烟曲霉感染组和定植组大鼠BALF 检测Ct值分别为25.0±3.57、26.2±1.02，两组比较P＞0.05，烟曲霉感染组大鼠第1d、第4d、第7d BALF检测Ct值分别为26.0±3.51、25.8±5.42和23.3±1.25，三个时间点比较P＞0.05。烟曲霉感染组大鼠第1d、第4d、第7d血清检测Ct值分别为25.0±1.44、24.5±1.27和22.2±2.40，三个时间点比较P＞0.05。以Ct值为25作为诊断阈值时，RT-PCR检测血清烟曲霉DNA诊断IPA的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为71.4%、87.5%、83.3%和75.0%；接种完成后第1d、第4d和第7d血清烟曲霉DNA检测诊断IPA的敏感性分别为40%、75%和100%。
结论 ①RT-PCR检测大鼠血清烟曲霉DNA能区分烟曲霉感染与烟曲霉口咽定植，但检测BALF标本不能区分烟曲霉感染与定植；②以Ct值为25作为诊断阈值时诊断IA的敏感性、特异性较理想；③RT-PCR检测大鼠血清烟曲霉DNA可早期诊断IPA，其敏感性随感染时间延长而增加。